експресія генів, экспрессия генов ; клонування, клонирование ; пептиди, пептиды
Human beta-defensins (hBDs) are small cationic antimicrobial peptides with multiple biologic activities. The aim of the study was cloning, expression in E.coli, purification and in vitro analysis of biological activity of recombinant human beta-defensin-3 (rec-hBD-3). hBD-3 cDNA was cloned into pGEX-2T vector, and recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21(DE3) cells. Rec-hBD-3 was expressed in bacterial cells as GST-hBD-3 fusion protein, and purified by 3-step procedure via affine chromatography on glutathione-agarose, cleavage of fusion protein by thrombin, and reverse phase chromatography on Sep-Pack C18. Analysis of biological activity of rec-hBD-3 has shown that the peptide is active against Pseudomonas aeruginosa in micromolar concentrations in radial diffusion test. Rec-hBD-3 did not affect proliferation and viability of cultured human cancer cells of A431, A549, and TPC-1 lines, but was capable to potentiate cytotoxic effects of rec-hBD-2 and docetaxel in vitro.
Бета-дефенсини людини (human beta-defensins, hBDs) - це невеликі за розміром катіонні антимікробні пептиди з широким спектром біологічної активності. Метою дослідження було клонувати та експресувати в E.coli рекомбінантний бета-дефенсин-3 людини (rec-hBD-3), провести його очистку та проаналізувати in vitro біологічну активність цього пептиду. кДНК hBD-3 було клоновано у вектор pGEX-2T, надалі рекомбінантною плазмідою було трансформовано клітини E.coli BL21(DE3). Rec-hBD-3 було експресовано в бактеріальних клітинах у вигляді злитого білка GST-hBD-3 та очищено шляхом афінної хроматографії на глютатіонагарозі, розщеплення злитого білка тромбіном та розділення продуктів протеолізу зворотньофазовою хроматографіэю на носії Sep-Pack C18. Аналіз біологічної активності rec-hBD-3 показав, що рекомбінантний пептид є активним проти Pseudomonas aeruginosa в мікромолярних концентраціях в тесті радіальної дифузії, не впливає на проліферацію та життєздатність культивованих пухлинних клітин людини ліній A431, A549 та TPC-1, але є здатним підсилювати цитотоксичні ефекти rec-hBD-2 та доцетакселу in vitro.
Бета-дефенсины человека (human beta-defensins. hBDs) - это катионные антимикробные пептиды с широким спектром биологической активности. Целью исследования было клонировать и экспрессировать в E.coli рекомбинантный бета-дефенсин-3 человека (rec-hBD-3), провести его очистку и проанализировать in vitro биологическую активность этого пептида. кДНК hBD-3 клонировали в вектор pGEX-2T, рекомбинантной плазмидой трансформировали клетки E.coli BL21(DE3). Rec-hBD-3 экспрессировали в бактериальных клетках в виде слитого белка GST-hBD-3 и очищали путем аффинной хроматографии на глютатионагарозе, расщепления слитого белка тромбином и разделения продуктов протеолиза обратнофазовой хроматографией на Sep-Pack C18. Анализ биологической активности rec-hBD-3 показал, что рекомбинантный пептид активен против Pseudomonas aeruginosa в микромолярных концентраціях в тесте радиальной диффузии, не влияет на пролиферацию и жизнеспособность культивированных опухолевых клеток линий A431, A549 и TPC-1, однако способен усиливать цитотоксические эффекты rec-hBD-2 идоцетаксела in vitro.
